Электронный каталог

Поиск по каталогу:

ПЦР

     Сокращение длительности цикла ПЦР – это привлекательное предложение для большинства исследователей, использующих этот метод, поскольку позволяет быстрее получить необходимый продукт реакции и увеличить производительность без необходимости закупать дополнительные амплификаторы. Так как в быстрой ПЦР используются ферменты дикого типа, это часто приводит к понижению чувствительности и увеличению частоты ошибок при использовании в различных сочетаниях матрицы и затравки.

     Компания «KAPA Biosystems» успешно применила свою технологию «молекулярной эволюции» для создания ДНК-полимераз специально для быстрой ПЦР. Два процессивных фермента под названием KAPA2G Fast и KAPA HiFi обеспечивают действительно быструю ПЦР при обычных условиях (стандартной концентрации реагентов) без потерь в производительности и чувствительности. Сокращение длительности ПЦР достигается не за счёт искусственного сокращения стадий денатурации и отжига, но, в первую очередь, благодаря тому, что эти быстрые ДНК-полимеразы позволяют значительно уменьшить период элонгации, в отличие от ферментов дикого типа (семейства A и B). Оба фермента существуют и в модификации для ПЦР горячего старта (hot start), основанной на антителах.

Методика ПЦР используется или для определения специфических нуклеотидных последовательностей, или для копирования участка ДНК, что используется в различных исследованиях: в секвенировании, клонировании, направленном мутагенезе, сборке синтетического гена из коротких олигонуклеотидов, а также в изучении экспрессии белка. Хотя Taq ДНК-полимераза и полимеразы второго поколения семейства А, такие как KAPA2G Robust (устойчивая) и KAPA2G Fast (быстрая), дают высокую надёжность и чувствительность при определении последовательности нуклеотидов, но при их применении наблюдается относительно высокая частота появления ошибок (2.4 x 10E-5). Поэтому полимеразы семейства А не подходят для получения длинных ампликонов, так как при появлении ошибок становится невозможным дальнейшее удлинение ампликона. Таким образом, ДНК-полимеразы семейства А не годятся для безошибочной амплификации длинных участков гена, использующихся для сборки синтетического гена.

Высокоточные полимеразы дикого типа семейства В дают примерно в 20 раз меньше ошибок амплификации, чем Taq ДНК-полимераза, благодаря их экзонуклеазным или корректирующим свойствам. Но при этом известно, что многие полимеразы семейства B, такие как Pfu, Vent и KOD, отличаются низкой чувствительностью, небольшой специфичностью праймеров, малой скоростью работы и низкой эффективностью.

 

ДНК-полимераза KAPA HiFi (высокоточная) – это синтезированная полимераза семейства B, благодаря которой удалось преодолеть ограничения высокоточной ПЦР первого поколения. Новая уникальная ДНК-полимераза KAPA HiFi, оптимизированный под неё реакционный буфер и протоколы устанавливают новые стандарты чувствительности, специфичности и скорости в ПЦР олигонуклеотидов с минимумом ошибок для сборки синтетического гена. Данная полимераза есть также в антителоопосредованном варианте для ПЦР с горячим стартом (hot start). KAPA HiFi даёт ряд существенных преимуществ:

• минимальная частота появления ошибок - 2,8 x 10E7 ошибок на нуклеотид (точность работы - в 100 раз выше, чем у Taq ДНК-полимеразы)

• возможность амплификации длинных матриц до 15 т.п.о. (при исследовании фрагментов ДНК генома) и даже до 18 т.п.о. (при исследовании плазмидной ДНК)

• возможность работы со сложными матрицами (например, с высоким G,C-составом), благодаря смеси из двух оптимизированных реакционных буферов

• высокая скорость амплификации (30 сек. на 1 т.п.о. за цикл)

«Горячий старт» (hot start) – это термин, описывающий неактивное состояние ДНК-полимеразы вплоть до инициирующей стадии денатурации ДНК в ПЦР. Методика горячего старта (hot start) позволяет избежать появления побочных продуктов амплификации, которые возникают в стандартной ПЦР на стадии подготовки смеси реагентов и снижают эффективность ПЦР.

Существует несколько методов временной инактивации ДНК-полимеразы, таких как химическая модификация (например, ангидридом формальдегида), физическая модификация (например, с помощью прослойки парафина), связывание аптамером, секвестрация праймера, изоляция с помощью антител, а также использование дополнительных термолабильных веществ, блокирующих dNTPs, или праймеры.

     Под такой ПЦР обычно понимается амплификация фрагментов ДНК длиной более 5 т.п.о., используя смесь термостабильных ДНК-полимераз, которая позволяет проводить амплификацию более длинных матриц, чем отдельная полимераза. Такая смесь состоит в основном, из ДНК-
полимеразы семейства А (например, Taq) с добавлением небольшого количества полимеразы семейства B или высокоточной ДНК-полимеразы (например, Pfu). Оба фермента обеспечивают специфичную полимеразную активность в направлении 5’–3’, но только полимераза семейства B обеспечивает экзонуклеазную и репарационную активность в направлении 3’–5’.

Высокоскоростная и высокопроизводительная мультиплексная ПЦР без необходимости строгой оптимизации условий.

Компания «KAPA Biosystems» предлагает Вам наборы реагентов для ПЦР в режиме реального времени (real-time) как для высокоспецифичной детекции результатов ПЦР с помощью ДНК-зондов, так и для низкоспецифичной детекции с помощью красителей.

С момента её изобретения в 1993 г. ПЦР в режиме реального времени (real-time), также известная как количественная (qPCR), считается одним из самых бурно развивающихся методов амплификации. ПЦР в режиме реального времени (real-time) основана на принципах традиционной ПЦР или ПЦР с детекцией по «конечной точке» (end-point). В qPCR происходит сбор данных с помощью флуорофоров от одной или нескольких точек взаимодействия праймер-матрица в течение ряда циклов ПЦР. Этот метод используется для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК после каждого цикла реакции.

     Позволяют оптимизировать Ваши ПЦР с помощью унификации протоколов и условий реакции, ускорения процесса, минимизации ошибок при работе со сложными матрицами и увеличения чувствительности полимеразы – и всё это обеспечивается одним ферментом.

     С ДНК-полимеразой  KAPA Taq для стандартной ПЦР.

     Компания «KAPA Biosystems» в партнерстве с компанией «КэмБио» рада предложить Вам уникальные наборы для быстрой амплификации ДНК-матриц непосредственно в необработанной пробе ткани растения, мыши, а также в пробе крови.

     Компания Kapa Biosystems в партнерстве с компанией «КэмБио» рада предложить Вам наборы для подготовки образцов для секвенирования при помощи технологий нового поколения (Next Generation Sequencing, NGS).